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在流式細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)中，除了血液樣本，幾乎所有的樣本均為實(shí)體組織，如脾臟、肝臟、腎臟、脂肪、腫瘤等，那么為了做好流式的檢測，我們首先得將實(shí)體組織消化成為活性較佳的單細(xì)胞懸液。

那么怎樣得到活性較佳的單細(xì)胞懸液呢？今天小晶為大家?guī)砜蛻糇稍兌嗟膶?shí)體組織的單細(xì)胞懸液提取，以小鼠脾臟、小鼠腫瘤組織的提取為例，感興趣的話就跟小晶一起往下學(xué)習(xí)吧。

一、小鼠脾臟單細(xì)胞懸液制備

脾臟是體內(nèi)大的免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，負(fù)責(zé)機(jī)體的造血、紅細(xì)胞清除和免疫功能。一般免疫研究者很難逃過對脾臟的研究，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的熱門研究，均有脾臟的身影，那么怎么獲得活性非常好的脾臟單個(gè)細(xì)胞呢？

詳情步驟：

① 獲取新鮮的小鼠脾臟，小鼠的脾臟呈橢圓形狀，可以直接用鑷子拉扯分離。將小鼠脾臟放入預(yù)冷的有適量 HBSS緩沖液的培養(yǎng)皿或大小適中的離心管中，并使用手術(shù)剪或眼科剪，小心將脾臟剪碎。

② 將細(xì)胞篩網(wǎng)放在50 mL 離心管上方，使用一次性移液器，將剪碎后的脾臟轉(zhuǎn)移到細(xì)胞篩網(wǎng)輕輕的搗碎或碾壓，使其通過篩網(wǎng)。必要時(shí)，加入5–10 mL PBS 沖洗。重復(fù)上述步驟，可使用1 mL注射器進(jìn)行驗(yàn)證，若通過篩網(wǎng)的細(xì)胞懸液使用注射器（帶針頭）進(jìn)行反復(fù)吹打，則可認(rèn)為單細(xì)胞懸液制備完成。

③ 將流式細(xì)胞懸液在4°C下，以400-600 g 或1500 rpm 離心細(xì)胞10 min，棄上清，用2–5 mL 預(yù)冷的1x PBS 重懸細(xì)胞。將重懸液置于冰上備用，必要時(shí)可以對細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)染色初步判斷活率，也可對細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整至合適的細(xì)胞濃度后根據(jù)檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e進(jìn)行染色、上機(jī)檢測。

二、小鼠腫瘤組織單細(xì)胞懸液制備

小鼠腫瘤發(fā)病特征和人類腫瘤很相似，因此對人類腫瘤的研究有很高的價(jià)值，而對應(yīng)的小鼠腫瘤動(dòng)物模型的類型及其建立方法，對腫瘤研究起到至關(guān)重要的作用。進(jìn)一步，如何更好地利用實(shí)驗(yàn)材料驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)論，關(guān)鍵在于對腫瘤組織的檢測方法。其中流式檢測腫瘤組織的免疫功能就成了超級熱點(diǎn)，那么怎么才能得到活性較好的、干擾較少的腫瘤組織單細(xì)胞懸液用于流式檢測呢？跟小晶一起學(xué)習(xí)一下吧！

詳情步驟：

① 沿腫瘤組織輕輕剪開，盡可能完整的剝離整個(gè)腫瘤，將剝離好的腫瘤放入預(yù)冷的有適量 HBSS緩沖液的培養(yǎng)皿或大小適中的離心管中，盡量冰上放置保持細(xì)胞良好活性。

② 并使用手術(shù)剪或眼科剪，小幅度、高頻的方式將腫瘤塊剪碎，大約剪成＜1mm2大小（肉眼看呈泥漿狀），整個(gè)過程建議在冰上操作，使用適量的 PBS 進(jìn)行洗滌，1500 rpm 離心10 min，沉淀的組織樣本待消化。

③ 每樣本加入2-3 mL 配置好的消化液（可根據(jù)腫瘤大小調(diào)整1×消化液的用量），用1 mL 槍頭將腫瘤組織碎末打散，置于37 °C 恒溫?fù)u床，300 rpm 搖晃，使酶與組織充分接觸，約消化30 min 左右，期間每15 min 取出吹打一次，可取一滴觀察細(xì)胞分離情況，從而適當(dāng)調(diào)整消化分離時(shí)間，消化時(shí)間不宜過長，以免影響免疫細(xì)胞活性。

④ 消化完畢后，加入3 mL（組織量過多可成倍加入含5%血清的 DMEM 終止消化。用巴氏吸管吸取消化后的腫瘤組織懸液至70 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，同時(shí)用1 mL 注射器后部研磨遺留在濾網(wǎng)上的組織塊，所得懸液4 °C，50 g 離心10 min，收集上清，則為腫瘤細(xì)胞懸液。

⑤ 根據(jù)所購買的淋巴流式細(xì)胞分離液，對腫瘤懸液進(jìn)行 PBMC 的提取，提取出中間白膜層后根據(jù)檢測的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e進(jìn)行染色、上機(jī)檢測。